巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成分，具有抗感染、抗肿瘤和参与免疫应答、免疫调节等生物学功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和炎症的重要对象。
巨噬细胞的极化
巨噬细胞具有异质性和多样性，可在不同的组织微环境和生理病理条件下，转化为不同的表型，称为巨噬细胞的极化。
巨噬细胞组织分布多样性和异质性的特点，使之一直以来都是科研工作者们热门研究的对象。
根据细胞表面标记分子、细胞因子分泌及代谢相关基因特征，巨噬细胞通常被分为经典活化的M1型巨噬细胞（促炎）和选择性活化的M2型巨噬细胞（抗炎）。
■ M1型巨噬细胞表达MHC II、CD80、CD86和 CD16/32，分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎因子，以及CXCL9、CXCL10和CXCL11等趋化因子。
■ 另外，M2型巨噬细胞高表达arginase-1(Arg1)和CD206，分泌抗炎因子IL-10以及CCL2、CCL17和CCL22等趋化因子。
（DOI: 10.3389/fimmu.2019.00792）
巨噬细胞极化的体外研究，通常使用脂多糖（LPS）和干扰素（IFN-γ）等TLR激动剂诱导M1型极化，使用IL-4或IL-13等诱导M2型极化，然后记录基因表达、细胞表面标志物及蛋白质含量和活性的变化。
原代小鼠巨噬细胞可以从多个部位获得：比如骨髓、腹腔、肺或脂肪组织等。目前巨噬细胞的分离的方法主要包括贴壁筛选法、密度梯度离心法、酶消化法、流式细胞仪分离法等。
下面具体介绍小鼠腹腔巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞的提取和分离。
腹腔巨噬细胞提取
巨噬细胞天然存在于小鼠腹腔，腹腔巨噬细胞多游离存在于腹水中易于获得：用生理盐水或细胞培养基冲洗腹腔后抽取腹腔灌洗液体，即可获取其中的巨噬细胞。
以下为具体实验方案：
（1）巨噬细胞的诱导
在实验前3天，连续3天给小鼠腹腔注射1mL的3%巯基乙酸盐肉汤，每天1次。（肉汤刺激是非感染性炎症刺激，能促进巨噬细胞的聚集）
注：
■ 腹腔注射是关键，给肉汤时记得回抽，切记不能刺到器官导致小鼠腹腔出血，否则会使提取的巨噬细胞不纯。
■ 硫乙醇酸盐的作用是将巨噬细胞由外周血中释放入腹腔中，可提取更多的巨噬细胞用于实验，腹腔巨噬细胞多为M1促炎型。
（2）3天后，收集巨噬细胞
① 处死小鼠
准备75%乙醇，小鼠麻醉后，以脱颈方式处死小鼠，将小鼠置于75%乙醇中浸泡3-5min进行灭菌消毒处理后（注：使小鼠的腹腔朝下浸没在酒精中），移入超净台，仰卧位固定小鼠。
② 暴露腹膜
将小鼠外皮拉起，沿腹部剪开一个小口（注意勿将腹膜剪破），再剪开整个腹部皮肤，捏住两侧皮肤慢慢向两边撕开，使腹膜暴露。
③ 向腹腔注射生理盐水或细胞培养基：
于右下腹部将5mL预冷的PBS（或5mL预冷的10%血清RPMI-1640培养液）缓缓注入腹腔（注意不要抽进空气），轻揉小鼠腹部数次，静置3-5min，使液体在腹腔内充分流动。
注：
■ 腹腔注射直接会接触表皮，易污染，此步骤需要多加注意。
■ 腹腔注射培养基后，按压动作要轻柔缓慢，以防培养基从针孔溢出。
④ 抽取腹腔液，转移至离心管中（反复冲洗腹膜腔灌洗液2次）。
（3）巨噬细胞的纯化与培养
将收集的腹腔灌洗液于常温条件下1000r /min 离心5min，弃去上清，所得细胞沉淀用RPMI-1640培养液重悬接种，培养体系于37℃静置培养2～3h后，洗去未贴壁细胞，余下的贴壁细胞即为巨噬细胞。
注：由于腹腔巨噬细胞的粘附能力不强，清洗的时候动作要尽可能轻。
注意事项
■ 小鼠腹腔注射刺激物时不要刺破内脏，可以在操作过程中将小鼠头部向下抓取，使其腹部内容物滑向膈下以避开注射器针头；
■ 若回收的小鼠腹腔灌洗液过少，可另外注入预冷的PBS重复灌洗；
■ 若不小心致腹腔出血，可在腹腔液离心后重悬时加入5倍细胞悬液体积的红细胞裂解液，再次离心弃上层红色液体。
■ 尽量避免被小鼠咬伤或吸过小鼠腹腔液的针头扎伤，一旦被咬伤或扎伤，要到专门机构尽快注射出血热疫苗，如果创面大，需同时注射破伤风疫苗。
骨髓来源巨噬细胞的提取
在原代巨噬细胞的获取中，直接分离的腹腔巨噬细胞（或者肺泡巨噬细胞）数量有限，在未经诱导时，每只小鼠只能获取1.5-3×106个腹腔巨噬细胞，不能满足某些实验的需求，因此骨髓诱导分化的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages，BMDM）是目前实验室最常用的分离小鼠巨噬细胞的选择。
以下为具体实验方案：
（1）诱导因子的获取
M-CSF是一种诱导骨髓细胞向M2型巨噬细胞分化的诱导因子，获取的途径有两种：
1）找商业化的细胞因子产品直接购买，但不同厂家的细胞因子活性差异较大，需仔细甄别。M-CSF的使用浓度在20-50ng/mL即可。
2）自己培养能够分泌这种细胞因子的细胞，其中L929细胞上清含有较高活性M-GSF以及其它多种细胞因子，比如VEGF、MCP-1、MIG、IL-9/10等。该培养体系可以在短时间内获得大量巨噬细胞样的细胞，并且该体系不适合其它细胞生长，因而其它各系细胞会逐步死亡，经换液去除悬浮细胞后，最终可以获得大量纯化的骨髓巨噬细胞样细胞。
（2）骨髓巨噬细胞的分离
1）取腿骨
准备75%乙醇，小鼠麻醉后，脊髓脱臼法处死小鼠，将小鼠置于75%乙醇中浸泡5min进行灭菌消毒处理；
转移到超净工作台，固定小鼠上肢，用剪刀从腹部中线剪开，取其双侧股骨和胫骨，剔除骨上附着的肌肉和组织（注意：应尽量将肌肉组织去除，只留下骨头，整个过程务必保持股骨及胫骨的完整性！）
将去皮去肉的股骨、胫骨放置在含有75%乙醇的培养皿内浸泡5min（注：75%乙醇对骨髓细胞没有影响，但尽量要控制在5 min之内），然后用冷的PBS浸泡，洗去胫骨、股骨表面的乙醇，5min。
（DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100246）
2）骨髓巨噬细胞提取和诱导
将清洗好的股骨、胫骨分开，并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断，使用1-2mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹洗3次，直至骨内看不到明显的红色为止。
（DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100246）
此时可能会有红色条状物质，这是聚集的骨髓细胞，用5mL移液枪将含有骨髓细胞的培养基反复吹打，将块状的细胞团吹散。
然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛，转移至15mL离心管中，1500rpm/min离心5min，弃上清。
加入红细胞裂解液重悬，轻弹管底，混悬细胞沉淀，静置5min后，加入10 mL 冰PBS进行洗涤，4°C，1500rpm/min离心5min，弃上清（必要时重复，直至细胞团块红色部分明显减少），用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基重悬，铺板。
细胞培养期间，每隔2-3天更换新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基，加入培养基前用PBS清洗细胞，培养7天后收集细胞。
注意事项：
■ 骨髓巨噬细胞不可传代，不可以用胰酶消化，使用时可用细胞刮直接刮下来或者用枪吹打下来，然后离心计数即可用于实验。
■ 建议直接铺板用于后续实验，更换培养容器会损伤细胞。
■ 细胞诱导成功后要及时使用，不宜长时间培养。
（DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100246）
参考来源：
【1】Isolation and Differentiation of Murine Macrophages，DOI: 10.1007/978-1-4939-6625-7_23
【2】Preparation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice for functional analysis，DOI: 10.1016/j.xpro.2020.100246
